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一种提高发酵液中红曲色素色价的方法

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成果类型:
专利
发明/设计人:
刘俊;柴雪莹;郭亭;吴井艳;罗运川;...
申请/专利权人:
中南林业科技大学
专利类型:
发明专利
语种:
中文
申请时间:
2019-03-27
申请/专利号:
CN201910239058.4
公开时间:
2019-08-02
公开号:
CN110079544A
主申请人地址:
410004 湖南省长沙市韶山南路498号
申请地区:
湖南
机构署名:
本校为第一完成单位
主权项:
1.一种提高发酵液中红曲色素色价的方法,其特征在于:利用基因敲除技术使红曲霉菌中编码C-24(28)-甾醇还原酶的ERG4基因缺失,得到重组菌株,利用所述重组菌株发酵产红曲霉素。 2.根据权利要求1所述提高发酵液中红曲色素色价的方法,其特征在于:所述红曲霉菌为紫色红曲霉菌M. purpureus;所述编码C-24(28)-甾醇还原酶的ERG4基因为monascus_08018,其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。 3.根据权利要求1或2所述提高发酵液中红曲色素色价的方法,其特征在于:所述基因敲除技术是利用同源重组技术,通过根癌农杆菌EHA105介导转化T-DNA技术使得紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018缺失,包括以下步骤: (1)利用软件分析编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018的核苷酸序列; (2)以紫色红曲霉菌M. purpureus LQ-6的cDNA 为模板,以8018-up-osc-F和8018-up-osc-R为第一对引物,以8018-dn-osc-F和8018-dn-osc-R为第二对引物,将两对引物分别进行PCR扩增得到monascus_08018基因的5'端和3'端同源臂片段;所述8018-up-osc-F的序列为SEQ ID No:2;所述8018-up-osc-R的序列为SEQ ID No:3;所述8018-dn-osc-F的序列为SEQ ID No:4;所述8018-dn-osc-R的序列为SEQ ID No:5; (3)以质粒pXS为模板,以G418-F和G418-R为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段;所述G418-F的序列为SEQ ID No:6;所述G418-R的序列为SEQ ID No:7; (4)采用Overlap PCR技术,以monascus_08018基因的5'端和3'端同源臂片段以及G418基因片段为模板,以8018-up-osc-F和8018-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△8018目的片段; (5)用EcoR I和Sal I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300,胶回收线性化载体,利用一步克隆技术连接线性化双元载体pCAMBIA1300与△8018目的片段,即得到基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018;所述质粒pCAMBIA1300-△8018序列为SEQ ID No:12; (6)根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018,转化至紫色红曲霉菌中,筛选阳性克隆,即得到所述的液态发酵中红曲色素高产菌株。 4.根据权利要求3所述提高发酵液中红曲色素的方法,其特征在于:步骤(2)中所述紫色红曲霉M. purpureus LQ-6于2018年09月07日在中国典型保藏中心保藏,保藏编号是CCTCC M 2018600。 5.根据权利要求3或4所述提高发酵液中红曲色素色价的方法,其特征在于:步骤(6)中所述根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018是通过液氮冻融法将所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018导入根癌农杆菌EHA105,具体步骤如下:取2 μg所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中,混匀后冰浴30 min;液氮中速冻1min,后用37℃金属浴保温3 min;加入800 μL的YEB液体培养基,28℃培养3h;室温下以5000 rpm的转速离心5min,浓缩菌体;取200 μL浓缩后的菌液涂布于含有50 mg/L 利福平、50 mg/L卡那霉素的YEB选择性培养基平板上,28℃倒置培养48 h;挑选转化子于YEB液体培养基中培养,并用引物对克隆子进行筛选,得到阳性克隆子,即为含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105。 6.根据权利要求3~5之一所述提高发酵液中红曲色素色价的方法,其特征在于,步骤(6)中所述含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105转化至紫色红曲霉菌中的步骤如下:将红曲菌接种到PDA斜培养基,30℃培养7d,用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子,通过两层无菌擦镜纸过滤,调节孢子浓度;取含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105,接种于3mL含50μg/mL 利福平,50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中,28℃,220rpm培养12~24h,取250μL的菌液于50mLMM培养基中,在相同条件下培养2d,测培养基中农杆菌的值,并用IM培养基稀释菌液至OD600值为0.15;再在相同条件下培养6h得农杆菌液备用;将所得的紫色红曲霉孢子液和含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105菌液,混合涂布于铺有玻璃纸的含200 μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上,25℃共培养。 7.根据权利要求3~6之一所述的提高发酵液中红曲色素色价的方法,其特征在于,步骤(6)中所述筛选阳性克隆的具体步骤如下:将共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中,然后倒入约含有50 μg/mL G418和500 μg/mL头孢霉素的PDA培养基,25℃培养,从第2天开始观察,将长出的菌落挑至含50 μg/mL G418的PDA培养基上,30℃培养7d;如果在培养基上仍然能生长,即推定为转化子,并将之接种到PDB液体培养基中培养,按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析,以提取基因组为模板,用两对引物8018-T-F和8018-T-R、G418-T-F和8018-half-R进行PCR验证,选取阳性菌株;所述8018-T-F的序列为SEQ IDNo:8;所述8018-T-R的序列为SEQ ID No:9;所述G418-T-F的序列为SEQ ID No:10;所述8018-half-R的序列为SEQ ID No:11。 8.根据权利要求3~7之一所述提高发酵液中红曲色素的方法,其特征在于:所述根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备方法如下:将根癌农杆菌EHA105接种于5~10 mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中,以温度28℃、转速200 rpm的条件培养约24~48 h至对数生长期;取500 μL活化的菌液接种于20 mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中,以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD600=0.5;将菌液冰浴30 min后,在4℃条件下以5000rpm的转速离心5 min,弃上清,收集菌体;用50 mmol/L CaCl2洗涤菌体两次,再重悬于2 mL50 mmol/L CaCl2中,得到根癌农杆菌EHA105感受态细胞。
摘要:
一种提高发酵液中红曲色素色价的方法,是通过红曲霉菌自带的同源重组系统,利用根癌农杆菌介导(ATMT)转化T‑DNA技术完成红曲霉菌中编码C‑24(28)甾醇还原酶的ERG4基因敲除,得到红曲色素高产菌株。本发明能够显著性提高发酵液中红曲色素的生产水平,液态发酵(10d)结果显示,出发菌株胞外色价和总色价分别为14.57 U/mL、106.54 U/mL,本发明构建的重组菌株胞外色价和总色价分别为21.55U/mL、112.78U/mL,胞外色价和总色价分别提高了47.90%、5.86%。

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