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一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法

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成果类型:
专利
发明/设计人:
陈昊;王阳;张付豪
申请/专利权人:
中南林业科技大学
专利类型:
发明专利
语种:
中文
申请时间:
2019-08-16
申请/专利号:
CN201910756254.9
公开时间:
2019-10-22
公开号:
CN110358722A
主申请人地址:
410004 湖南省长沙市韶山南路498号
申请地区:
湖南
机构署名:
本校为第一完成单位
主权项:
1.一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤: 步骤一、材料选取:获取无菌山苍子叶片; 步骤二、叶片酶解:将所述无菌山苍子叶片切成条状碎块,置于酶解液中,黑暗条件下静置酶解6-12小时,所述条状碎块与所述酶解液的质量体积比为1-3:30-50,g/ml;所述酶解液中包括纤维素酶R-10、离析酶R-10、维生素C、PEG 4000和吐温80; 步骤三、原生质体分离:将酶解完成后的酶解液进行过滤,取滤液经离心处理,弃上清液,得原生质体; 步骤四、原生质体纯化:在步骤三所得原生质体中加入原生质体洗涤液A,重悬原生质体;随后加入原生质体洗涤液B,离心后,收集液面分界处的原生质体细胞,即得。 2.根据权利要求1所述的山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,步骤一的具体操作为:采集长势良好、无病虫害的山苍子叶片,将采集的叶片用0.1%的升汞溶液灭菌3-5分钟,即得无菌山苍子叶片;或者利用组织培养技术获得无菌的山苍子培苗,以山苍子培苗的幼叶作为无菌山苍子叶片。 3.根据权利要求1所述的山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,步骤二中,所述酶解液含有以下终浓度的各组分:10-20g/l纤维素酶R-10、10-20g/l离析酶R-10、91-128g/l甘露醇、0.1-0.3g/l磷酸二氢钠、1-2g/l吗啉乙磺酸、2-4g/l二水氯化钙、0.5-1g/l维生素C、1-5g/lPEG 4000和5-10g/l吐温80,所述酶解液的pH为5.8-6.0。 4.根据权利要求1所述的山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,步骤三的具体操作为:将酶解完成后的酶解液经45微米孔径的不锈钢滤网过滤至离心管中,以800-1200rpm/min转速,离心3-6分钟,弃上清液,得原生质体。 5.根据权利要求1所述的山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,步骤四中,所述原生质体洗涤液A中含有以下终浓度的各组分:甘露醇110-130g/l,磷酸二氢钾0.01-0.03g/l,硝酸钾0.1-0.3g/l,七水硫酸镁0.1-0.3g/l,碘化钾0.0001-0.0003g/l,五水硫酸铜0.00001-0.00003g/l,二水氯化钙1-2g/l;所述原生质体洗涤液A的pH为5.8-6.0。 6.根据权利要求1所述的山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,步骤四中,所述原生质体洗涤液B中含有以下终浓度的各组分:蔗糖200-300g/l,磷酸二氢钾0.01-0.03g/l,硝酸钾0.1-0.3g/l,七水硫酸镁0.1-0.3g/l,碘化钾0.0001-0.0003g/l,五水硫酸铜0.00001-0.00003g/l,二水氯化钙1-2g/l;所述原生质体洗涤液B的pH为5.8-6.0。 7.根据权利要求1所述的山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,步骤四中所述离心具体为800-1200rpm/min转速下离心2-4分钟;所述原生质体洗涤液A和所述原生质体洗涤液B的体积比为(0.5-1):(2-3)。 8.根据权利要求1所述的山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,所述步骤四之后还包括: 步骤五、原生质体的保存:在步骤四所得的原生质体细胞中加入原生质体培养液,重悬,置于6-8℃低温保存。 9.根据权利要求8所述的山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,其特征在于,所述原生质体培养液中含有以下终浓度的各组分:葡萄糖0.5-1g/l,氯化钠5-10g/l,二水氯化钙18-22g/l,氯化钾0.2-0.5g/l,吗啉乙磺酸0.2-0.5g/l;所述原生质体培养液的pH为5.8-6.0。
摘要:
本发明公开的一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法,包括以下步骤:获取无菌山苍子叶片;将无菌山苍子叶片切成条状碎块,置于酶解液中,黑暗条件下静置酶解6‑12小时,条状碎块与酶解液的质量体积比为1‑3:30‑50;将酶解完成后的酶解液进行过滤,取滤液经离心处理,弃上清液,得原生质体;在所得原生质体中加入原生质体洗涤液A,重悬原生质体;随后加入原生质体洗涤液B,离心后,收集液面分界处的原生质体细胞,即得。本发明提供的制备方法能够高效获取山苍子叶肉细胞原生质体,所得原生质体形态正常,无破损,每克鲜叶组织可获得(8.69±0.57)×106个原生质体,为山苍子的基础研究和应用研...

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