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蛹虫草子实体发育阶段内参基因、引物、筛选方法及应用

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成果类型:
专利
发明/设计人:
刘勇男;刘必扬;马酉初;刘高强
申请/专利权人:
中南林业科技大学
专利类型:
发明专利
语种:
中文
申请时间:
2019-12-05
申请/专利号:
CN201911237280.7
公开时间:
2020-02-11
公开号:
CN110777217A
主申请人地址:
410004 湖南省长沙市天心区韶山南路498号
申请地区:
湖南
机构署名:
本校为第一完成单位
主权项:
1.一种蛹虫草子实体发育阶段内参基因,其特征在于:所述内参基因为TUB,所述TUB的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。 2.根据权利要求1所述蛹虫草子实体发育阶段内参基因,其特征在于:所述发育阶段包括菌丝期、原基期、伸长期和成熟期。 3.一种如权利要求1或2所述蛹虫草子实体发育阶段内参基因的引物,其特征在于:所述TUB的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-14。 4.一种如权利要求1或2所述蛹虫草子实体发育阶段内参基因的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)选择12个内参基因TUB、EF-1α、UBC、GTPB、RPS、ACTIN、FBOX、CYP、GAPDH、PP2A、PGK、UBQ作为备选内参基因,并设计其荧光定量PCR引物; (2)诱导蛹虫草子实体发育,分别收集处于菌丝期的蛹虫草菌丝样品,以及原基期、伸长期和成熟期的蛹虫草子实体样品,立即提取总RNA,测定RNA浓度,将RNA反转录合成cDNA,然后以cDNA为模板,以步骤(1)的引物利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行分析; (3)采用GeNorm,NormFinder和BestKeeper软件对实时荧光定量PCR数据进行内参基因Ct值稳定性分析,从而筛选出蛹虫草子实体发育阶段最稳定表达的内参基因。 5.根据权利要求4所述蛹虫草子实体发育阶段内参基因的筛选方法,其特征在于:步骤(1)中,所述12个内参基因的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:1-12;所述12个内参基因的正向、反向引物利用primer5.0软件设计;所述12个内参基因的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-36。 6.根据权利要求4或5所述蛹虫草子实体发育阶段内参基因的筛选方法,其特征在于:步骤(2)中,所述蛹虫草的培养条件为:将蛹虫草菌丝接种于含有大米培养基的玻璃瓶中,恒温遮光培养至菌丝长满大米培养基,即成;所述大米培养基的配方为:大米、蚕蛹粉与营养液以固液比30~50:1:40~60混匀;所述营养液的配方为:每1000mL蒸馏水中含有葡萄糖15~25 g、KH2PO4 1~3g、MgSO4 0.5~1.5g、柠檬酸铵0.5~1.5g、蛋白胨4~6g、维生素B115~25mg;所述恒温遮光培养的温度为20~28℃,时间为20~30天;所述诱导蛹虫草子实体发育的方法为:在温度和光照的循环诱导下,将蛹虫草继续培养至菌丝期、原基期、伸长期和成熟期;所述温度和光照的循环诱导是指:在各发育阶段内,每日先于20~25℃下,光照处理12~16h,再于15~20℃下,遮光处理8~12h;所述菌丝期为第28~32天,所述原基期为第38~42天,所述伸长期为第48~52天,所述成熟期为第60~70天;所述实时荧光定量PCR的扩增体系由cDNA、PCR buffer Mix、正向引物、反向引物和双蒸水以体积比1:8~12:1:1:5~10组成;所述cDNA按10倍等比稀释成4~8个不同浓度的稀释液作为模板;所述实时荧光定量PCR的反应体系由cDNA稀释液、荧光试剂、正向引物、反向引物和双蒸水以体积比1:8~12:1:1:5~10组成;所述实时荧光定量PCR的反应条件为:90~95℃预变性25~35s,90~95℃变性5~15s,50~60℃退火25~35s,共30~50个循环,然后进行55~95℃熔解曲线分析,每0.5℃收集一次荧光信号。 7.根据权利要求4~6之一所述蛹虫草子实体发育阶段内参基因的筛选方法,其特征在于:步骤(3)中,所述GeNorm软件通过标准化因子配对差异分析得出两两比较的变异值V,最终选择适合的内参基因数量,当Vn/n+1值小于阈值0.15时,最合适的基因内参数目为n,选择前n个基因作为内参基因;所述NormFinder软件直接运算出各基因的表达稳定值M,根据M值的大小排序,M值越小,稳定性越高;所述BestKeeper软件通过原始Ct值和引物扩增效率决定出最适内参基因,并依次排序,稳定值小于1的内参基因,定性为稳定的内参基因。 8.一种如权利要求1或2所述蛹虫草子实体发育阶段内参基因的应用,其特征在于:以TUB为内参基因,使用实时荧光定量PCR检测与子实体发育相关的目的基因在蛹虫草子实体不同发育阶段的相对表达量。 9.根据权利要求8所述蛹虫草子实体发育阶段内参基因的应用,其特征在于:所述与子实体发育相关的目的基因为磷脂酶蛋白基因;所述磷脂酶蛋白基因为PLA、PLC、PLD;所述PLA、PLC、PLD的核苷酸序列为SEQ ID NO:37-39;所述PLA、PLC、PLD的正向、反向引物利用primer5.0软件设计;所述PLA、PLC、PLD的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:40-45。
摘要:
蛹虫草子实体发育阶段内参基因、引物、筛选方法及应用,所述内参基因为TUB,核苷酸序列为SEQ ID NO:1。TUB的正向、反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:13‑14。所述筛选方法为:(1)选择12个内参基因为备选内参基因,设计引物;(2)诱导蛹虫草子实体发育,提取不同发育阶段的总RNA,测定RNA浓度,将RNA反转录合成cDNA,以cDNA为模板,利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行分析;(3)实时荧光定量PCR数据进行Ct值分析,筛选出稳定内参基因。所述应用是以TUB为内参基因,检测目的基因不同发育阶段的相对表达量。所述内参基因稳定性好;所述方法简单、快捷、成本低。

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